微管对狂犬病病毒胞内感染的影响

打开文本图片集

摘要：狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）依赖宿主细胞完成其感染周期，且在胞浆内复制。微管作为一种细胞骨架，是介导胞内物质运输的重要通道。为探究狂犬病病毒胞内感染是否依赖于细胞骨架——微管，利用小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a），接种实验室标准攻击毒株CVS-11，通过诺考达唑（Nocodazole）抑制剂破坏微管形成，采用实时荧光定量PCR方法、Western Blot方法、免疫荧光方法检测微管对于RABV感染量的影响，并采用TCID50法测定微管对RABV病毒滴度的影响。结果表明，Nocodazole通过抑制微管的形成，使RABV N基因水平降低25%、N蛋白水平降低50%，免疫荧光检测到病毒感染率降低70%，上清液中病毒滴度由106.5TCID50/mL降低至104.5TCID50/mL，说明狂犬病病毒胞内感染依赖于细胞骨架-微管的参与。该结果为进一步研究狂犬病病毒胞内运输及其复制机制的研究提供了理论依据。

关键词：狂犬病病毒;微管;诺考达唑;胞内感染

中图分类号：S851         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）10-0121-04

Abstract： Rabies virus （RABV） is entirely accomplished its infection in cells cytoplasmic. Cytoskeletal microtubules mediates cargoes to move throughout the cytoplasm. In this study， we investigated the modulatory effect of a microtubule-inhibitor， Nocodazole， on RABV infection in mouse Neuro-2a cells （N2a）. The N2a cells viability was analyzed by MTT. In cells treated with Nocodazole， then infected with laboratory challenge virus standard CVS-11. mRNA level and protein level of RABV were respectively reduced about 25% and 50% by real-time PCR and Western Blot. Significantly， viral infection rate was obviously decent 70% by immunofluorescence and the virus titer was decreased from 106.5TCID50/mL to 104.5TCID50/mL. These results indicated that RABV undergo intracellular transport mediated by cytoskeleton-microtubule. These results provide a theoretical basis for further study on the intracellular trafficking of RABV and its replication mechanism.

Key words： rabies virus; microtubule; Nocodazole; intracellular infection

狂犬病是由狂犬病毒属弹状病毒科的狂犬病病毒（RABV）引起神经系统障碍的一种高度致死性人兽共患传染病。其感染谱广，流行地区几乎遍及全球，每年约有1 500万人接受暴露后的预防，仍有超过6万人死于狂犬病，发病后致死率高达100%[1]。真核细胞中，细胞骨架主要由微管、微丝及中间纤维组成。微丝是由肌球蛋白单体（G-actin）形成的多聚体，位于细胞质膜内侧，主要参与细胞变形运动、胞质分裂、肌肉收缩及细胞器运动等生物功能。微管（Microtubules，MTs）是细胞质中由α、β微管蛋白组装的一种细长的中空圆管状细胞器结构，位于细胞核周围，在维持细胞形态、介导物质运输、染色体运动等生命活动中发挥重要作用[2]。微管的动力学过程对于在细胞微管执行胞内物质迁移及有丝分裂功能有重要影响，其动力学过程受GTP水解过程及微管相关蛋白的影响[3-5]。已有研究表明，病毒在细胞内的定向运输是通过劫持宿主细胞的胞内运输系统实现的[6]。研究发现，小鼠多瘤病毒（MpyV）[7]、牛乳头状瘤病毒（BPV）[8]、艾滋病毒（HIV）[9]、疱疹病毒[10]、痘苗病毒[11]等通过微管介导完成胞内运输。狂犬病病毒粒子以囊泡形式侵入细胞[12]。囊泡在细胞质内的运输是沿着细胞骨架微丝或微管运行的，运输动力来自分子马达[13]。抑止微管功能的药物很多，如紫杉醇、秋水仙素、长春花碱、诺考达唑（Nocodazole）等[2]。Nocodazole通过结合β-微管蛋白抑制微管动力学过程，可阻碍二硫键形成和囊泡运输等功能[14]。因此本研究主要采用微管抑制剂Nocodazole抑止微管正常聚合功能，从而检测小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）内RABV感染量变化情况，以初步判定RABV胞内感染是否依赖于细胞骨架——微管，为进一步研究RABV胞内运输机制奠定基础。

1  材料与方法

1.1  细胞与毒株

小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）由人獸共患病研究教育部重点实验室留种冻存，RABV实验室标准攻击毒株CVS-11株由长春兽医研究所OIE参考试验室涂长春研究员惠赠。

1.2  试验试剂

细胞培养基高糖DMEM购自Gibco公司，胎牛血清FBS购自NQBB公司， Nocodazole购自Selleck公司，Anti-β tubulin抗体、MTT购自Sigma公司，荧光定量试剂FastStart Universal SYBR Green Master购自Roche公司。

1.3  药物配制及细胞活力检测

Nocodazole用DMSO溶解为1 mmol/L，-20 ℃冻存。将N2a细胞以104个/孔铺至96孔板中，37 ℃细胞培养箱培养12 h后，将药物用空培养基稀释后以0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L的浓度梯度加入细胞，37 ℃孵育6 h，PBS清洗后，更换为含1%双抗血清的培养基继续培养至24 h，加入5 mg/mL的MTT，37 ℃条件下培养4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL/孔溶解甲瓒结晶，摇床震荡15 min，492 nm波长测吸光度。数据采用以下公式计算：

细胞活力=（药物处理组吸光度-阴性对照组吸光度）/（无药对照组吸光度-阴性对照组吸光度）×100%。

1.4  实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

采用FastStart Universal SYBRGreen Master染料进行分析。试验所使用RABV N基因上、下游引物以及内参基因GAPDH上、下游引物[15]见表1。

PCR反应体系（共25 μL）：引物（上、下游）终浓度0.8 μmol/L，模板cDNA 1 μg，SYBR Green 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL。依次加入96孔板中，反应条件为95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环。将得到的Ct值采用2-ΔΔCt（Livak法）进行计算分析。

1.5  Western Blot

将N2a细胞以3×105个/孔铺至6孔板中，37 ℃细胞培养箱培养12 h后，将Nocodazole用空培养基稀释为25 μmol/L Nocodazole处理细胞，37 ℃下孵育1 h，接毒MOI=1的CVS-11，置37 ℃感作1 h，用PBS溶液清洗3次，加入含1%双抗血清的培养基继续培养24 h，RIPA裂解液裂解，收集细胞总蛋白，制样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗Anti-rabies Virus （5B12）4 ℃过夜，二抗室温孵育2 h。

1.6   免疫荧光

将N2a细胞以1×105个/孔铺至12孔板内爬片上，37 ℃细胞培养箱培养12 h后，将Nocodazole用空培养基稀释至25 μmol/L处理细胞，37 ℃下孵育1 h，接毒MOI=1的CVS-11，置37 ℃感作1 h，用PBS溶液清洗3次，加入含1%双抗血清的培养基继续培养至24 h。4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，0.1%Triton X-100打孔10 min，5%羊血清室温封闭2 h，孵育Anti-β tubulin抗体及FITC标记的抗RABV N蛋白抗体，激光共聚焦显微镜下观察。

1.7  病毒滴度测定

将N2a细胞以104个/孔铺至96孔板中，37 ℃细胞培养箱培养12 h，Nocodazole处理后接毒CVS-11 24 h的细胞上清，依次以10倍倍比稀释加入到96孔板N2a细胞中，每个梯度设4个复孔，37 ℃下培养48 h，弃上清，PBS溶液轻洗后，80%冷丙酮固定细胞，PBS清洗3次，加入FITC标记的抗RABV N蛋白抗体37 ℃下孵育1 h。观察荧光孔数，用Spearman-Karber法计算TCID50值。

1.8  统计分析

所有数据分析使用GraphPad Prism 6，免疫荧光信号强度采用Image J软件分析，数据均用x±s表示，试验组与对照组均用SPSS软件进行t检验，差异显著*概率值0.01

2  结果与分析

2.1  MTT法检测细胞活力

为验证微管对RABV胞内感染的影响，用Nocodazole作为抑制微管形成的药物处理细胞。应用MTT法检测药物Nocodazole对N2a细胞的毒性，结果如图1。与对照组相比，3.125～25 μmol/L Nocodazole处理组吸光度无显著差异。当Nocodazole达到50 μmol/L时，吸光度显著降低，说明50 μmol/L Nocodazole对细胞有毒性作用，故本试验选择25 μmol/L作为Nocodazole的最适药物作用浓度。

2.2  RT-qPCR检测基因水平狂犬病病毒感染量

在细胞培养板中铺适宜密度的N2a细胞，37 ℃过夜培养后弃掉上清液，加入25 μmol/L Nocodazole处理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培养24 h收集细胞总RNA，以RT-qPCR方法检测 RABV N基因表达量，结果如图2，表明Nocodazole处理N2a细胞后RABV N基因拷贝数显著降低25%。

2.3  Western Blot检测蛋白水平狂犬病病毒感染量

在细胞培养板中铺适宜密度的N2a细胞，37 ℃过夜培养后弃掉上清液，加入25 μmol/L Nocodazole处理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培养24 h收集细胞总蛋白，采用Western blot方法检测 RABV N蛋白表达量变化情况，结果如图3A，与对照组相比加药组RABV N蛋白有降低趨势，灰度分析如图3B，结果表明，Nocodazole药物处理后RABV N蛋白表达量显著降低约50%，检测结果与基因水平一致。

2.4  免疫荧光检测蛋白水平狂犬病病毒感染量

在细胞培养板中铺适宜密度的N2a细胞，37 ℃过夜培养后弃掉上清液，加入25 μmol/L Nocodazole处理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培养24 h后采用免疫荧光方法检测微管对RABV感染率的影响。20倍镜下感染RABV N蛋白结果如图4A，表明RABV感染率有明显下降趋势，荧光强度分析如图4B，与对照组相比，试验组病毒感染率显著降低约为70%，验证了之前的结论。3 000倍镜下观察可见微管形态改变，细胞形态也有所变化，单细胞内病毒感染也明显减少（图4C）。这些结果均说明Nocodazole通过阻碍微管形成显著抑制了RABV的感染。

2.5  TCID50测定病毒滴度

在细胞培养板中铺适宜密度的N2a细胞，37 ℃过夜培养后弃上清，加入Nocodazole处理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培养24 h后收集上清检测病毒滴度，结果显示Nocodazole处理N2a细胞后上清中病毒滴度显著降低（图5），其病毒滴度由106.5TCID50/mL降低至104.5TCID50/mL，进一步证实破坏微管形成后RABV的胞内感染受到抑制。

3  讨论

狂犬病是由RABV引起神经系统障碍的一种高度致死性人畜共患传染病[1]。RABV致病机制至今尚未阐明。本研究通过Nocodazole处理N2a细胞，并成功检测到RABV胞内感染受到显著抑制，表明RABV借助微管进行胞内感染过程，而在原代神经元乃至体内RABV是否借助于微管的运输机制仍需进一步探索。

驱动蛋白（kinesin）和胞质动力蛋白（dynein）作为与微管结合发挥作用的两大类马达蛋白，与病毒胞内运输有密切关联[13]，已有研究发现多瘤病毒属中MpyV借助微管及马达分子dynein进行胞内运输[7]，而kinesin、dynein和RABV胞内运输之间的关联尚不十分清楚。病毒从入胞转运到复制中心是由微管介导的逆向运输实现的，病毒出胞则是依赖微管介导的正向运输。Nocodazole处理细胞后，上清中病毒滴度显著降低说明病毒出芽到胞外过程受到一定程度的阻碍，微管所介导的正向运输是否在RABV感染过程中起主导作用，并且驱动蛋白和胞质动力蛋白在RABV感染的不同阶段充当怎样不同的角色有待研究。

参考文献：

[1] SINGH R，SINGH K P，CHERIAN S，et al. Rabies-epidemiology，pathogenesis，public health concerns and advances in diagnosis and control：a comprehensive review.[J].Veterinary quarterly，2017，37（1）：212-251.

[2] 韩贻仁.分子细胞生物学[M].第四版.北京：科学出版社，2012.

[3] KODAMA A.Coordinating cytoskeletal tracks to polarize cellular movements[J].The journal of cell biology，2004，167（2）：203-207.

[4] ERICKSON H P，O"BRIEN E T. Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis[J].Annual review of biophysics & biomolecular structure，1992，21（21）：145.

[5] HOWARD J，HYMAN A A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end[J].Nature，2003，422（6933）：753-758.

[6] 曹晶晶.猪圆环病毒2的胞内运输机制研究[D].杭州：浙江大学， 2014.

[7] VOJTECH Z，FRANCESCO D，LUCIE K，et al. Involvement of microtubular network and its motors in productive endocytic trafficking of mouse polyomavirus[J].PLoS ONE，2014，9（5）：e96922.

[8] FLORIN L，BECKER K A，LAMBERT C，et al. Identification of a dynein interacting domain in the papillomavirus minor capsid protein L2[J].Journal of virology，2006，80（13）：6691-6696.

[9] MCDONALD D.Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells[J].The journal of cell biology，2002，159（3）：441-452.

[10] SODEIK B，EBERSOLD M W，HELENIUS A.Microtubule-mediatedtransport of incoming herpes simplex virus 1capsids to the nu-cleus[J].J Cell Biol，1997，136（5）：1007-1021.

[11] WARD B M，MOSS B. Vaccinia vrus intracellular movement is associated with microtubules and independent of actin tails[J].Journal of virology，2001，75（23）：11651-11663.

[12] PICCINOTTI S，WHELAN S P J. Rabies internalizes into primary peripheral neurons via clathrin coated pits and requires fusion at the cell body[J].PLoS pathogens，2016，12（7）：e1005753.

[13] SHEETZ M P. Motor and cargo interactions[J].European journal of biochemistry，1999，262（1）：19.

[14] CID-ARREGUI A，PARTON R G，SIMONS K，et al. Nocodazole-dependent transport， and brefeldin A--sensitive processing and sorting，of newly synthesized membrane proteins in cultured neurons[J].Journal of neuroscience the official journal of the society for neuroscience，1995，15（6）：4259-4269.

[15] 楊玉姣.狂犬病病毒靶向RNA干扰制剂的研制与鉴定研究[D].长春：吉林大学，2013.

推荐访问： 微管 狂犬病 感染 病毒 影响