摘要[目的]了解世界各地EV71病毒的亲缘关系。[方法]下载了NCBI数据库所有EV71全基因组序列，以常用的Kimura 2parameter距离和E距离进行距离矩阵邻接法建树。[结果] 基于E距离和Kimura 2parameter距离构建的进化树结果一致，2种方法均支持EV71进化树反映出的基于全基因组的病毒亲缘关系。[结论]E距离是病毒系统发育应用中另一种颇具潜力的新距离，能为鉴定EV71病毒亲缘关系提供支持。
关键词 EV71病毒；全基因组；E距离；Kimura 2parameter距离；亲缘关系
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10469-03
基金项目国家自然科学基金青年项目（31301388）；中国博士后面上项目（2014M562109）；湖南省自然科学基金项目（14JJ3092）；湖南省科学技术厅科技计划项目（2014GK3046）。
作者简介徐西林（1991- ），女，湖南新邵人，硕士研究生，研究方向：生物信息学。*通讯作者，讲师，博士，硕士生导师，从事生物信息学方面的研究。
手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是由多种人肠道病毒引起的儿童常见急性传染疾病[1]，主要肠道病毒包括肠道病毒7l型（Enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（Coxsackie virus A16，CoxA16）[2-3]。EV71及CA16所致的手足口病在临床症状上难以区分，但EV71感染易伴发无菌性脑炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等，危害更大，致死率较高[4-6]。
人肠道病毒EV71型于1969年在美国加利福尼亚州从一例脑炎病例中首次分离得到[7]，自此该病毒在全世界范围内均有暴发和流行。我国于1981年在上海首次报道手足口病的流行，此后在北京、河北、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东等省（市）均有报道[4]。EV71病毒属于小RNA病毒科肠道病毒A组成员，基因组单股正链RNA[8]。病毒颗粒为二十面体对称球形结构，无包膜和突起，直径为24～30 nm。基因组长度约7 405 bp，仅有1个开放读码框架[9]，编码4个结构蛋白（VP4、VP2、VP3、VP1）和7个非结构蛋白[10]。
Kimura 2parameter距离是构建系统进化树的常用距离法，E距离法是根据各碱基π电子共振能来计算不同序列间的分子进化距离[11]。笔者以2种不同距离方法为基础，对目前公布的所有EV71毒株全基因序列进行分析，研究世界范围内EV71的遗传学背景和进化关系。
1材料与方法
1.1材料从美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中搜索肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）全基因组序列（下载截止日期：2013年11月15日）。为了数据的后续分析及准确性，进一步从EV71全基因组序列中筛选出注释有具体地区来源的开发阅读框（ORF）代表序列。
1.2方法分子系统发育分析是生物信息学中的重要研究领域[12]，主要研究手段是选取一组同源的DNA或蛋白质序列，通过计算各个序列间的进化距离构建反映物种进化关系的进化树[13]。构建进化树的方法主要有距离法、最大简约法、最大似然法3种。距离法是比较常用的一种构树方法[14]，通过计算各序列之间的距离得到一个距离矩阵，采用特定的聚类算法对距离矩阵进行分析得到进化树。该研究以邻接法（NeighborJoining，NJ）为基础，以2种不同的距离方法构建系统发育进化树。
1.2.1Kimura 2parameter距离模型。NJ法构建进化树时需选择模型，对于核酸序列一般选择Kimura 2parameter模型。打开MEGA6.06软件，导入序列文件data>>选择数据类型“Nucleotide Sequences”，构建系统发育树Phylogeny>>Construct NeighborJoining Tree>>模型选择“Kimura 2parameter model”，点击compute计算生成进化树并保存。
1.2.2E距离参数模型。E距离是基于π电子共振能发展的一种新的计算分子进化距离的方法，其计算公式来源于群落生态学中群落相异性系数公式。在群落生态学中，采用物种数、频率、信息量等计算群落相似性或相异性系数是测定群落相似性的一套较成熟的方法。群落相异性系数的公式为：D=1-2ca+b，式中，D为相异性指数，a为A群落中物种数，b为B群落中物种数，c为A、B 2个群落中共有物种数。E距离是将比较两序列看作两群落并按位比较，用群落相异性系数公式来计算序列间的分子进化距离。已知各碱基π电子共振能比值为T∶C∶G∶A=0.17∶0.23∶0.27∶0.32，E距离可定义为：E=1-2ca+b，其中a、b分别为序列A、B的碱基π电子共振能和，c为序列A、B按位比较时共有的碱基π电子共振能和。该研究先计算序列两两比对获得E距离矩阵，再利用MEGA6.06基于E距离参数模型和NJ法构建系统进化树。
2结果与分析
2.1EV71核酸序列信息以2013年11月15日NCBI的核酸数据库为准，获得EV71基因组序列共221条，其中140条序列来自中国的20个省份，60条序列来自国外11个城市，21条序列地区未知（表1）。去除地区注释不明序列后，按地域对序列进行分类，从来源于同一地区的序列中选出1条作为该地域的代表序列，最终共选取31条EV71病毒ORF区域代表序列（表2），序列长度均为6 582 bp。
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